Nestekromatografian periaatteet

hyödynnettävistä yhteisvaikutuksista riippumatta nestekromatografia suoritetaan kuudessa vaiheessa:

• kolonnin tasapainotila
• näytteen kuormitus
• pesu
• Eluutio
• Loppukolonnin pesu
• kolonnin regenerointi

kolonnin tasapainotila

useimmat nestekromatografiaprotokollat alkavat hartsin tasapainotilalla. Kolonnin päälle johdetaan puskuria, joka on yhteensopiva kiinnostavan proteiinin ja valitun hartsin kanssa. Yleinen käytäntö on, että kolonni tasapainotetaan 5-10 kolonnin tilavuudella (CVs) tasapainotuspuskuria.

esimerkiksi proteiinien sitoutuminen hydrofobisiin vuorovaikutushartseihin on tehokkainta suurella ionivahvuudella. Ennen näytteen antamista hartsi tasapainotetaan siten puskurissa, jolla on suuri ionilujuus.

tärkeän proteiinin ominaisuuksia tarkastellaan myös tasapainotilassa tapahtuvassa puskurivalinnassa, sillä puskurikertoimia, kuten ionilujuutta, rajoittaa proteiinin stabiilisuus; tyypillisesti vältettäisiin tasapainotilassa olevat puskuriolosuhteet, jotka denaturoisivat kiinnostavan proteiinin tai estäisivät sen vuorovaikutuksen stationäärifaasin kanssa.

näytteen kuormitus

tasapainotuksen jälkeen näyte Ladataan kolonniin. Näyte ladataan yleensä puskuriin, jonka koostumus on sama kuin tasapainotuspuskurin, jotta proteiinin vuorovaikutus stationäärifaasin kanssa olisi mahdollisimman suuri.

näytettä voidaan ladata manuaalisesti tai näytepumpulla. Jotkin kromatografiatyypit rajoittavat kolonniin ladattavan näytteen määrää. Toinen tärkeä näytteen lastaus huomioon on, että useimmat hartsit on rajallinen kyky sitoa proteiinia; ylikuormitus kolonnin soveltamalla liikaa näytettä voi vaikuttaa haitallisesti erottaminen.

Kolonnipesu

kun proteiinit on immobilisoitu stationäärifaasissa, proteiinit, jotka vuorovaikuttavat hartsin kanssa vain heikosti tai ei-spesifisesti, poistetaan pesemällä kolonni useilla pesupuskurimäärillä. Tällä pesupuskurilla voi olla sama koostumus kuin tasapainotuspuskurilla tai se voi sisältää komponentteja, jotka häiritsevät heikkoja spesifisiä yhteisvaikutuksia.

esimerkiksi immobilisoidun metallin affiniteettikromatografia (IMAC) eluoi hartsiin sitoutuneita proteiineja, joiden immidatsolipitoisuus on suuri. Yleinen käytäntö on käyttää pesupuskuria, joka sisältää välivaiheen immidatsolipitoisuuden, poistamaan kontaminoivat proteiinit, jotka ovat vain heikosti sitoutuneita hartsiin.

kolonnia pestään, kunnes eluaatissa ei havaita proteiinia. Käytettäessä KROMATOGRAFIAJÄRJESTELMÄÄ, jossa on UV-detektori, kolonnia pestään, kunnes 280 nm: n absorptiolukema palautuu lähtötasolle.

näytteen Eluutio

kun kaikki epäspesifisesti ja heikosti vaikuttavat proteiinit on pesty pois hartsista, voimakkaasti hartsin kanssa vuorovaikutuksessa olevat proteiinit eluoidaan kolonnista muuttamalla hartsin yli kulkevan puskurin koostumusta.

ioninvaihtokromatografiassa proteiinit eluoidaan korkean ionilujuuden puskureilla tai pH: n muutoksella häiritsemään sähköstaattisia vuorovaikutuksia, jotka immobilisoivat kiinnostavan proteiinin. Hydrofobiseen vuorovaikutushartsiin sitoutuneet proteiinit puolestaan eluoituvat alentamalla puskurin ionivahvuutta. Affiniteettikromatografiassa proteiinit eluoidaan yleensä kolonnista tuomalla kilpaileva ligandi tai pilkkomalla affiniteettitagi, ja ne voidaan eluoida myös runsassuolaisilla puskureilla tai muuttamalla pH: ta. Muissa eluutiomenetelmissä voidaan sekoittaa polaarisuudeltaan vaihtelevia liuottimia kunkin komponentin liukoisuuden virittämiseksi liikkuvassa faasissa.

Kuva. 3: esimerkki puskurikoostumuskaavioista isokraattisille (ylä -) ja gradienttisille (ala -) eluutioprotokollille.

Eluutiotiloja voidaan muuttaa joko lineaarisella gradientilla tai portaittain. Usein valitaan gradienttieluutioprotokolla, jossa liikkuvan faasin koostumus muuttuu lineaarisesti ajan myötä, jotta voidaan määrittää eluutioprofiili ja eluutiopuskuripitoisuus, jolla kiinnostava proteiini vapautuu hartsista. Kun tämä pitoisuus on määritetty, voidaan ajan säästämiseksi suunnitella vaiheittainen isokraattinen eluutioprotokolla, jossa liikkuvan faasin koostumus on vakio jokaisessa vaiheessa, tulevia puhdistuksia varten.

Huom.: Koon poissulkukromatografia ei vaadi puskurimuutoksia, koska se ei riipu liikkuvan faasin ja stationäärifaasin spesifisistä vuorovaikutuksista. Varsinaisia pesu-ja eluutiovaiheita ei ole, sillä SEC luottaa yksinomaan siihen, että suuret molekyylit hidastuvat huokoisten helmien vaikutuksesta, kun taas pienet molekyylit kulkevat hartsin läpi vähäisellä hartsin vuorovaikutuksella.

Loppukolonnipesu

kun kiinnostava proteiini on eluoitu hartsista, kaikki hartsiin sitoutuneet proteiinit eluoidaan lisäämällä eluutiopuskurin vahvuutta. Tässä vaiheessa sarakkeet voidaan käyttää uudelleen tuleviin erotuksiin.

kolonnin regenerointi

jäljellä olevien väliaineeseen sitoutuneiden yhdisteiden poistamisen jälkeen kolonni joko kyllästetään tasapainotuspuskurilla myöhempää uudelleenkäyttöä varten tai täytetään varastointipuskurilla.