folyadékkromatográfia alapelvei

a kihasználandó kölcsönhatásoktól függetlenül a folyadékoszlop-kromatográfiát hat lépésben végezzük:

• Oszlopkiegyenlítés
• Minta betöltése
• mosás
• elúció
• végső oszlopmosás
• Oszlopregenerálás

Oszlopkiegyenlítés

a legtöbb folyadékkromatográfiás protokoll gyantaegyensúlyozási lépéssel kezdődik. A puffer, amely kompatibilis a fehérje az érdeklődés és a gyanta választott vezetjük át az oszlopon. Általános gyakorlat az oszlop kiegyensúlyozása 5-10 oszloptérfogattal (CVs) egyensúlyi puffer.

például a fehérjék hidrofób kölcsönhatási gyantákhoz való kötődése a leghatékonyabb nagy Ionos szilárdság mellett. A minta alkalmazása előtt a gyantát ezért nagy Ionos szilárdságú pufferben egyensúlyba hozzuk.

a kérdéses fehérje tulajdonságait az egyensúlyi puffer kiválasztásában is figyelembe vesszük, mivel a puffertényezőket, például az ionos erősséget a fehérje stabilitása korlátozza; általában elkerülhető lenne az egyensúlyi pufferfeltételek, amelyek denaturálnák a kérdéses fehérjét, vagy megakadályoznák, hogy kölcsönhatásba lépjen az állófázissal.

Minta betöltése

az egyensúlyozás után a mintát az oszlopra töltik. A mintát általában az egyensúlyi pufferrel azonos összetételű pufferbe töltik, hogy maximalizálják a fehérje kölcsönhatását az állófázissal.

a minta manuálisan vagy mintaszivattyúval tölthető be. Bizonyos típusú kromatográfia korlátozza az oszlopra betölthető minta mennyiségét. Egy másik fontos mintaterhelési szempont, hogy a legtöbb gyanta véges kapacitással rendelkezik a fehérje megkötésére; egy oszlop túlterhelése túl sok minta alkalmazásával hátrányosan befolyásolhatja az elválasztást.

Oszlopmosás

miután a fehérjéket immobilizálták az állófázison, azokat a fehérjéket, amelyek csak gyengén vagy nem specifikusan lépnek kölcsönhatásba a gyantával, eltávolítják az oszlop több oszloptérfogatú mosópufferrel történő mosásával. Ez a mosópuffer ugyanolyan összetételű lehet, mint az egyensúlyi puffer, vagy tartalmazhat olyan komponenseket, amelyek megzavarják a gyenge specifikus kölcsönhatásokat.

például az immobilizált fém affinitás kromatográfia (IMAC) magas immidazolkoncentrációval elutálja a gyantához kötött fehérjéket. Általános gyakorlat egy mosópuffer használata, amely magában foglalja az immidazol közbenső koncentrációját a szennyező fehérjék kiküszöbölésére, amelyek csak gyengén kötődnek a gyantához.

az oszlopot addig mossuk, amíg az eluátumban nem észlelhető fehérje. UV-detektorral ellátott kromatográfiás rendszer használata esetén az oszlopot addig mossuk, amíg a 280 nm-es abszorpciós leolvasás vissza nem tér az alapvonalra.

Minta elúció

Miután az összes nem specifikusan és gyengén kölcsönhatásban lévő fehérjét lemossuk a gyantáról, a gyantával erősen kölcsönhatásba lépő fehérjéket a gyantán átvezetett puffer összetételének megváltoztatásával eluáljuk az oszlopról.

az ioncserélő kromatográfiában a fehérjéket nagy Ionos erősségű pufferekkel vagy pH–változással eluálják, hogy megzavarják az elektrosztatikus kölcsönhatásokat, amelyek immobilizálták a kérdéses fehérjét. A hidrofób interakciós gyantához kötött fehérjék ezzel szemben a puffer Ionos szilárdságának csökkentésével eluálódnak. Az affinitáskromatográfiában a fehérjéket általában egy versengő ligandum bevezetésével vagy az affinitáscímke hasításával eluálják az oszlopról, és magas sótartalmú pufferekkel vagy a pH megváltoztatásával is eluálhatók. Más elúciós protokollok különböző polaritású oldószerek keverését vonhatják maguk után, hogy beállítsák az egyes komponensek oldhatóságát a mobil fázisban.

ábra. 3. példa pufferösszetétel-diagramok izokratikus (felső) és gradiens (alsó) elúciós protokollokhoz.

az elúciós feltételek vagy lineáris gradiens módon, vagy lépésenként változtathatók. Gyakran egy gradiens elúciós protokollt választanak, amelyben a mozgó fázis összetétele az idő múlásával lineárisan változik, az elúciós profil és az elúciós puffer koncentrációjának meghatározására, amelynél a kérdéses fehérje felszabadul a gyantából. Miután ezt a koncentrációt meghatároztuk, időmegtakarítás céljából egy lépésenkénti izokratikus elúciós protokollt lehet megtervezni, amelyben a mobil fázis összetétele minden lépésben állandó, a jövőbeni tisztításokhoz.

Megjegyzés: A méretkizárási kromatográfia nem igényel pufferváltozást, mivel nem függ a mozgófázis és az állófázis közötti specifikus kölcsönhatásoktól. Nincsenek valódi mosási és elúciós lépések, mivel a SEC kizárólag arra a tényre támaszkodik, hogy a nagy molekulákat porózus gyöngyök késleltetik, míg a kis molekulák minimális gyanta kölcsönhatással haladnak át a gyantán.

végső Oszlopmosás

miután a kérdéses fehérjét eluáltuk a gyantából, az elúciós puffer szilárdságának növelésével eluálunk minden olyan fehérjét, amely a gyantához kötődik. Ez a lépés lehetővé teszi az oszlopok újbóli felhasználását a jövőbeni elválasztásokhoz.

Oszlopregenerálás

a közeghez kötött maradék vegyületek lecsupaszítása után az oszlopot ezután vagy telítik egyensúlyi pufferrel a későbbi újrafelhasználás céljából, vagy tároló pufferrel töltik meg.