액체 크로마토그래피 원리

이용 중인 상호작용에 관계없이 액체 컬럼 크로마토그래피는 6 단계로 수행됩니다:

• 컬럼 평형
• 샘플 로딩
• 세척
• 용출
• 최종 컬럼 세척
• 컬럼 재생

컬럼 평형

대부분의 액체 크로마토그래피 프로토콜은 수지 평형 단계로 시작한다. 관심 있는 단백질 및 선택의 수지와 호환이 되는 완충기는 란에 통과됩니다. 일반적인 관행은 5-10 열 볼륨(이력서)으로 열을 평형화하는 것입니다.

예를 들어,소수성 상호 작용 수지에 대한 단백질의 결합은 높은 이온 강도에서 가장 효율적이다. 따라서 시료 적용 전에 수지는 높은 이온 강도의 완충액에서 평형을 이룹니다.

관심 있는 단백질의 특성은 평형 버퍼 선택에도 고려되며,이온 강도와 같은 완충 인자는 단백질 안정성에 의해 제한된다;전형적으로,관심 있는 단백질을 변성시키거나 정지상과 상호 작용하는 것을 방지하는 평형 버퍼 조건을 피할 것이다.

샘플 로딩

평형 후 샘플이 컬럼에 로드됩니다. 샘플은 일반적으로 고정상과의 단백질 상호 작용을 극대화하기 위해 평형 버퍼와 동일한 조성을 가진 버퍼에 적재됩니다.

샘플은 수동으로 또는 샘플 펌프를 사용하여 로드할 수 있습니다. 크로마토그래피의 일부 유형은 컬럼에 로드할 수 있는 샘플의 부피를 제한합니다. 또 다른 중요한 표본 선적 고려사항은 대부분의 수지에는 단백질을 묶는 유한 수용량이 있다 입니다;너무 많은 표본을 적용해서 란을 과대 적재하는 것은 불리하게 별거에 영향을 미칠 수 있습니다.

칼럼 세척

일단 단백질이 정지상 상에 고정되면,수지와 약하게 또는 비특정적으로만 상호작용하는 단백질은 칼럼을 여러 칼럼 부피의 세척 완충액으로 세척함으로써 제거된다. 이 세척 버퍼는 평형 버퍼와 동일한 조성을 갖거나 약한 특정 상호 작용을 방해하는 구성 요소를 포함 할 수 있습니다.

예를 들어,고정화-금속 친화성 크로마토그래피(아이맥)는 고농도의 이미다졸로 수지에 결합된 단백질을 용리한다. 일반적인 관행은 수지에 약하게 결합 된 오염 단백질을 제거하기 위해 중간 농도의 이미 다졸을 포함하는 세척 완충액을 사용하는 것입니다.

칼럼은 용리액에서 단백질이 검출되지 않을 때까지 세척된다. 자외선 검출기와 크로마토그래피 시스템을 사용하는 경우,컬럼은 280 나노미터 흡수 판독값이 기준선으로 돌아올 때까지 세척됩니다.

시료 용출

비특정적이고 약하게 상호작용하는 단백질을 모두 수지에서 씻어낸 후,수지와 강하게 상호작용하는 단백질은 수지 위에 전달되는 완충액의 조성을 변화시킴으로써 칼럼에서 용출된다.

이온 교환 크로마토그래피,단백질 높은 이온 강도 버퍼 또는 관심의 단백질을 고정 정전기 상호 작용을 방해 하는 산도에 변화를 용리 됩니다. 반대로 소수성 상호 작용 수지에 결합 된 단백질은 완충액의 이온 강도를 낮춤으로써 용출됩니다. 친 화성 크로마토그래피에서 단백질 경쟁 리간드의 도입 또는 친 화성 태그를 쪼개 하 여 열에서 일반적으로 용리 하 고 또한 높은 소금 버퍼 또는 변경 산도 사용 하 여 용리 수 있습니다. 다른 용출 프로토콜은 이동상 내의 각 성분의 용해도를 조정하기 위해 다양한 극성의 용매를 혼합하는 것을 포함할 수 있다.

그림. 3:등권(위)및 그라디언트(아래)용리 프로토콜에 대한 버퍼 구성 다이어그램의 예.

용출 조건은 선형 그라디언트 방식 또는 단계적 방식으로 변경할 수 있습니다. 종종,이동상의 구성 시간이 지남에 선형 변경 하는 그라디언트 용리 프로토콜 용리 프로필 및 용리 버퍼 농도 관심의 단백질 수 지에서 해방 됩니다를 결정 하기 위해 선택 됩니다. 이 농도가 결정되면 시간을 절약하기 위해 각 단계에서 이동상의 구성이 일정한 단계적 등권 용리 프로토콜을 미래의 정화를 위해 설계 할 수 있습니다.

주: 크기 제외 크로마토그래피는 이동상 및 고정상 사이의 특정 상호 작용에 의존하지 않기 때문에 버퍼 변경이 필요하지 않습니다. 초 큰 분자는 다공성 구슬,작은 분자 최소한의 수 지 상호 작용으로 수 지를 통과 하는 반면 지체 사실에 전적으로 의존 하는 진정한 세척 및 용리 단계 있다.

최종 컬럼 세척

관심 단백질이 수지로부터 용출된 후,수지에 결합된 상태로 남아 있는 임의의 단백질은 용출 완충액의 강도를 증가시킴으로써 용출된다. 이 단계에서는 향후 분리에 열을 다시 사용할 수 있습니다.

컬럼 재생

매질에 결합된 나머지 화합물을 스트리핑한 후,컬럼은 후속 재사용을 위해 평형 버퍼로 포화되거나 저장 버퍼로 채워진다.