vloeistofchromatografie Beginselen

Ongeacht de interacties die worden uitgebuit, vloeistof kolom chromatografie is uitgevoerd in zes stappen:

• Kolom verevening
• Sample laden
• Wassen
• Elutie
• Laatste kolom wassen
• Kolom regeneratie

Kolom Verevening

de Meeste liquid chromatography protocollen beginnen met een hars verevening stap. Een buffer die met de proteã ne van belang en de hars van keus compatibel is wordt overgegaan over de kolom. Een gangbare praktijk is om de kolom te equilibreren met 5-10 kolomvolumes (CVs) van equilibratiebuffer.

de binding van eiwitten aan hydrofobe interactieharsen is bijvoorbeeld het meest efficiënt bij hoge Ionische sterkte. Voorafgaand aan steekproeftoepassing, wordt de hars daarom in evenwicht gebracht in een buffer van hoge Ionische sterkte.

de eigenschappen van het betrokken eiwit worden ook in aanmerking genomen bij de selectie van equilibratiebuffers, aangezien bufferfactoren zoals Ionische sterkte worden beperkt door de stabiliteit van het eiwit; typisch zou men een equilibratiebuffercondities vermijden die het betrokken eiwit denatureren of verhinderen dat het interageert met de stationaire fase.

Monsterbelasting

na equilibratie wordt het monster in de kolom geladen. De steekproef wordt over het algemeen geladen in een buffer met dezelfde samenstelling als de evenwichtsbuffer om eiwitinteractie met de stationaire fase te maximaliseren.

het monster kan handmatig of met behulp van een monsterpomp worden geladen. Sommige types van chromatografie beperken het volume van steekproef dat op de kolom kan worden geladen. Een andere belangrijke overweging van de steekproeflading is dat de meeste harsen een eindige capaciteit hebben om proteã ne te binden; het overbelasting van een kolom door teveel steekproef toe te passen kan scheiding nadelig beà nvloeden.

kolom wassen

zodra eiwitten in de stationaire fase geïmmobiliseerd zijn, worden eiwitten die slechts zwak of niet specifiek met de hars interageren verwijderd door de kolom te wassen met verschillende kolomvolumes wasbuffer. Deze wasbuffer kan dezelfde samenstelling hebben als de evenwichtsbuffer of componenten bevatten die zwakke specifieke interacties verstoren.

iMac (immobilised-metal affinity chromatography) elueert bijvoorbeeld aan de hars gebonden eiwitten met een hoge concentratie immidazool. Een gemeenschappelijke praktijk is om een wasbuffer te gebruiken die een middenconcentratie van immidazole omvat om het besmetten proteã nen te elimineren die slechts zwak aan de hars worden gebonden.

de kolom wordt gewassen totdat er geen eiwit in het eluaat wordt gevonden. Wanneer het gebruiken van een chromatografiesysteem met een UV-detector, wordt de kolom gewassen tot de 280 nm absorptielezing aan de basislijn terugkeert.

Monster-elutie

nadat alle niet-specifieke en zwak interagerende eiwitten van de hars zijn afgewassen, worden eiwitten die sterk interageren met de hars uit de kolom geëlueerd door de samenstelling van de buffer die over de hars wordt geleid te wijzigen.

bij ionenwisselingschromatografie worden eiwitten geëlueerd met buffers met hoge ionsterkte of met een verandering in de pH om de elektrostatische interacties die het betrokken eiwit immobiliseerden, te verstoren. De proteã nen gebonden aan een hydrophobic interactiehars, omgekeerd, worden geëlueerd door de Ionische sterkte van de buffer te verlagen. In affiniteitschromatografie, worden de proteã nen algemeen van de kolom door de inleiding van concurrerende ligand geëlueerd of door het affiniteitmarkering te splijten en kunnen ook worden geëlueerd gebruikend hoog-zoute buffers of het veranderen van pH. Andere elutieprotocollen kunnen het mengen van oplosmiddelen van variërende polariteit impliceren om de oplosbaarheid van elke component in de mobiele fase af te stemmen.

Fig. 3: Voorbeeld buffersamenstelling diagrammen voor isocratische (boven) en gradiënt (onder) elutieprotocollen.

Elutievoorwaarden kunnen lineair of stapsgewijs worden gewijzigd. Vaak wordt een gradiënt-elutieprotocol gekozen, waarbij de samenstelling van de mobiele fase in de loop van de tijd lineair verandert, om het elutieprofiel en de elutiebufferconcentratie te bepalen waarbij de proteã ne van belang wordt bevrijd van de hars. Zodra deze concentratie is vastgesteld, kan om tijd te besparen, een stapsgewijs isocratisch elutieprotocol worden ontworpen, waarin de samenstelling van de mobiele fase constant is bij elke stap, voor toekomstige zuiveringen.

Noot: De chromatografie van de grootteuitsluiting vereist geen bufferveranderingen aangezien het niet van specifieke interactie tussen de mobiele fase en de stationaire fase afhangt. Er zijn geen echte was-en elutiestappen, aangezien SEC zich uitsluitend op het feit baseert dat grote molecules door poreuze parels worden vertraagd, terwijl kleine molecules door de hars met minimale harsinteractie overgaan.

laatste kolom wassen

nadat het betrokken eiwit uit de hars is geëlueerd, worden alle eiwitten die aan de hars blijven gebonden geëlueerd door de sterkte van de elutiebuffer te verhogen. Deze stap maakt het mogelijk kolommen te hergebruiken voor toekomstige scheidingen.

Kolomregeneratie

na het strippen van de resterende verbindingen die aan het medium gebonden zijn, wordt de kolom ofwel verzadigd met equilibratiebuffer voor later hergebruik, ofwel gevuld met een opslagbuffer.