principiile cromatografiei lichide

indiferent de interacțiunile care sunt exploatate, cromatografia coloanei lichide se realizează în șase etape:

• echilibrare coloană
• Încărcare probă
• spălare
• eluție
• spălare finală coloană
• regenerare coloană

echilibrare coloană

majoritatea protocoalelor de cromatografie lichidă încep cu o etapă de echilibrare a rășinii. Un tampon compatibil cu proteina de interes și rășina de alegere este trecut peste coloană. O practică obișnuită este echilibrarea coloanei cu 5-10 volume de coloane (CVs) de tampon de echilibrare.

de exemplu, legarea proteinelor la rășinile de interacțiune hidrofobă este cea mai eficientă la rezistență Ionică ridicată. Înainte de aplicarea eșantionului, rășina este, prin urmare, echilibrată într-un tampon cu rezistență Ionică ridicată.

proprietățile proteinei de interes sunt, de asemenea, luate în considerare în selecția tamponului de echilibrare, deoarece factorii tampon precum rezistența Ionică sunt limitați de stabilitatea proteinei; de obicei, s-ar evita condițiile tampon de echilibrare care ar denatura proteina de interes sau ar împiedica interacțiunea acesteia cu faza staționară.

încărcarea eșantionului

după echilibrare, eșantionul este încărcat pe coloană. Eșantionul este în general încărcat într-un tampon cu aceeași compoziție ca tamponul de echilibrare pentru a maximiza interacțiunea proteinei cu faza staționară.

eșantionul poate fi încărcat manual sau folosind o pompă de probă. Unele tipuri de cromatografie limitează volumul eșantionului care poate fi încărcat pe coloană. O altă considerație importantă de încărcare a eșantionului este că majoritatea rășinilor au o capacitate finită de a lega proteinele; supraîncărcarea unei coloane prin aplicarea prea multor probe poate afecta negativ separarea.

spălarea coloanei

odată ce proteinele au fost imobilizate în faza staționară, proteinele care interacționează doar slab sau nespecific cu rășina sunt îndepărtate prin spălarea coloanei cu mai multe volume de coloane de tampon de spălare. Acest tampon de spălare poate avea aceeași compoziție ca tamponul de echilibrare sau poate conține componente care perturbă interacțiunile specifice slabe.

de exemplu, cromatografia cu afinitate metalică imobilizată (IMAC) eluează proteinele legate de rășină cu o concentrație mare de imidazol. O practică obișnuită este utilizarea unui tampon de spălare care include o concentrație intermediară de imidazol pentru a elimina proteinele contaminante care sunt doar slab legate de rășină.

coloana este spălată până când nu este detectată nicio proteină în eluat. Când se utilizează un sistem de cromatografie cu un detector UV, coloana este spălată până când citirea absorbției de 280 nm revine la linia de bază.

eluția eșantionului

după ce toate proteinele care interacționează nespecific și slab au fost spălate din rășină, proteinele care interacționează puternic cu rășina sunt eluate din coloană prin schimbarea compoziției tamponului care este trecut peste rășină.

în cromatografia cu schimb ionic, proteinele sunt eluate cu tampoane de înaltă rezistență Ionică sau cu o modificare a pH–ului pentru a perturba interacțiunile electrostatice care au imobilizat proteina de interes. Proteinele legate de o rășină de interacțiune hidrofobă, dimpotrivă, sunt eluate prin scăderea rezistenței ionice a tamponului. În cromatografia de afinitate, proteinele sunt de obicei eluate din coloană prin introducerea unui ligand concurent sau prin scindarea etichetei de afinitate și pot fi, de asemenea, eluate folosind tampoane bogate în sare sau modificând pH-ul. Alte protocoale de eluție pot implica amestecarea solvenților cu polaritate variabilă pentru a regla solubilitatea fiecărei componente în faza mobilă.

Fig. 3: exemplu diagrame de compoziție tampon pentru protocoalele de eluție izocratice (sus) și gradient (jos).

condițiile de eluție pot fi modificate fie într-un mod gradient liniar, fie într-un mod treptat. Adesea, un protocol de eluție în gradient, în care compoziția fazei mobile se schimbă liniar în timp, este ales pentru a determina profilul de eluție și concentrația tamponului de eluție la care proteina de interes este eliberată de rășină. Odată ce această concentrație a fost determinată, pentru a economisi timp, un protocol de eluție izocratică în trepte, în care compoziția fazei mobile este constantă la fiecare pas, poate fi proiectat pentru purificări viitoare.

notă: Cromatografia de excludere a dimensiunii nu necesită modificări ale tamponului, deoarece nu depinde de interacțiunile specifice dintre faza mobilă și faza staționară. Nu există pași adevărați de spălare și eluție, deoarece SEC se bazează exclusiv pe faptul că moleculele mari sunt întârziate de margele poroase, în timp ce moleculele mici trec prin rășină cu o interacțiune minimă a rășinii.

spălarea finală a coloanei

după ce proteina de interes a fost eluată din rășină, orice proteine care rămân legate de rășină sunt eluate prin creșterea rezistenței tamponului de eluție. Acest pas permite reutilizarea coloanelor pentru separări viitoare.

regenerarea coloanei

după îndepărtarea compușilor rămași legați de mediu, coloana este apoi fie saturată cu tampon de echilibrare pentru reutilizare ulterioară, fie umplută cu un tampon de stocare.